作為每天要幫實(shí)驗(yàn)室客戶解決各種 Transwell 問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)耗材供應(yīng)商，我見(jiàn)過(guò)太多同學(xué)因?yàn)椴僮骷?xì)節(jié)沒(méi)把控好，明明細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)問(wèn)題，最后卻得不到能用的數(shù)據(jù) —— 要么膜上細(xì)胞太少，要么下室細(xì)胞污染，甚至連 Transwell 小室怎么放都能搞錯(cuò)。

其實(shí)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)本身不復(fù)雜，但90% 的失敗都藏在 “不起眼" 的細(xì)節(jié)里。今天就從 “耗材準(zhǔn)備 - 細(xì)胞處理 - 實(shí)驗(yàn)操作 - 結(jié)果統(tǒng)計(jì)" 全流程，把我總結(jié)的實(shí)操要點(diǎn)和避坑經(jīng)驗(yàn)分享給大家，新手照著做，基本能一次出有效數(shù)據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)前：耗材和試劑準(zhǔn)備，這些 “預(yù)處理" 別省

很多人拿到 Transwell 小室就直接用，其實(shí)第一步 “預(yù)處理" 沒(méi)做好，后續(xù)再努力也白費(fèi)。先明確：我們常用的 Transwell 小室（遷移實(shí)驗(yàn)用無(wú)基質(zhì)膠的，侵襲實(shí)驗(yàn)才加 Matrigel），核心是聚碳酸酯膜（孔徑一般選 8μm，除非細(xì)胞特別大 / 小，比如神經(jīng)元可能用 12μm），實(shí)驗(yàn)耗材膜的處理和試劑配比是關(guān)鍵。

1. Transwell 小室的預(yù)處理：別讓 “氣泡" 毀了實(shí)驗(yàn)

• 第一步：激活膜的親水性

新的小室膜是疏水的，細(xì)胞沒(méi)法附著遷移，必須先用水或培養(yǎng)基浸潤(rùn)激活。操作時(shí)用無(wú)菌槍頭吸取無(wú)血清培養(yǎng)基（或 PBS），緩慢加到小室內(nèi)部（膜上方），注意別戳到膜！加完后放在培養(yǎng)板孔里，室溫靜置 20-30 分鐘，讓膜充分吸水變親水。

? 避坑：別用血清培養(yǎng)基激活！血清里的蛋白會(huì)提前吸附在膜上，反而影響細(xì)胞遷移。

• 第二步：去除膜上殘留液體

激活后，用無(wú)菌吸頭輕輕吸掉小室內(nèi)部的培養(yǎng)基（動(dòng)作要輕，別把膜吸破），再把小室倒扣在無(wú)菌濾紙上吸 10 秒，把膜上多余的液體吸干 —— 殘留液體太多，會(huì)導(dǎo)致上室細(xì)胞懸液被稀釋，影響細(xì)胞密度。

2. 試劑配比：血清濃度是 “遷移動(dòng)力"，別亂加

Transwell 遷移的原理是 “趨化作用"：下室的血清（營(yíng)養(yǎng)）吸引上室的細(xì)胞穿過(guò)膜，所以上下室的血清濃度差是關(guān)鍵，配比錯(cuò)了細(xì)胞根本不遷移。

• 上室：無(wú)血清培養(yǎng)基（或含 0.1%-0.5% 血清，避免細(xì)胞饑餓過(guò)度，但濃度絕對(duì)不能高于下室）

• 下室：含 10%-20% 血清的培養(yǎng)基（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整，比如腫瘤細(xì)胞用 10% 足夠，成纖維細(xì)胞可能需要 20%）

?? 重點(diǎn)：下室加培養(yǎng)基時(shí)，要先加到培養(yǎng)板孔里，再放入預(yù)處理好的小室，避免小室下方產(chǎn)生氣泡 —— 氣泡會(huì)頂住膜，細(xì)胞穿不過(guò)去，最后下室沒(méi)細(xì)胞，白做！

二、細(xì)胞處理：狀態(tài)比數(shù)量更重要，這 3 步別錯(cuò)

很多同學(xué)糾結(jié) “上室加多少細(xì)胞"，其實(shí)比數(shù)量更重要的是細(xì)胞狀態(tài)—— passages 太多、有污染、貼壁不牢的細(xì)胞，遷移能力會(huì)差很多，數(shù)據(jù)根本不可信。

1. 細(xì)胞消化：別消化過(guò)度，避免損傷細(xì)胞膜

• 用胰酶消化時(shí)，看到細(xì)胞邊緣收縮、輕輕吹打能散開(kāi)就停，立刻加含血清的培養(yǎng)基終止消化（血清能中和胰酶）

• 別用槍頭猛吹，避免細(xì)胞破裂 —— 破裂的細(xì)胞會(huì)沉在膜上，最后計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)算成 “遷移細(xì)胞"，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏高。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：調(diào)整濃度，保證膜上細(xì)胞均勻

• 消化后的細(xì)胞離心（1000rpm，5 分鐘），棄上清，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸（和上室培養(yǎng)基一致），吹成單細(xì)胞懸液

• 計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度：一般上室加 2-5×10?個(gè)細(xì)胞 / 孔（24 孔板），具體看細(xì)胞大小 —— 比如 A549 細(xì)胞小，加 5×10?；HCT116 細(xì)胞大，加 2×10?。

? 技巧：如果不確定濃度，先做預(yù)實(shí)驗(yàn)（比如設(shè) 2、4、6×10?三個(gè)梯度），選 “24 小時(shí)后膜上還有少量未遷移細(xì)胞，下室有明顯遷移細(xì)胞" 的濃度。

3. 上室加樣：別讓細(xì)胞堆積在中間

• 加細(xì)胞懸液時(shí)，槍頭貼著小室內(nèi)壁緩慢加（別直接滴在膜上），加完后輕輕晃一下小室，讓細(xì)胞均勻分布在膜上

• 上室液體體積：24 孔板的小室，一般加 200μL（別加滿，留一點(diǎn)空間，避免液體溢出到下室）

• 加完后把培養(yǎng)板放進(jìn)孵箱，前 30 分鐘別碰—— 讓細(xì)胞先貼在膜上，避免移動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞聚堆。

三、孵育和染色：時(shí)間別亂定，染色步驟要 “輕"

孵育時(shí)間和染色方法，直接影響最后能不能清晰計(jì)數(shù)，新手常在這里踩坑。

1. 孵育時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞類型定，別盲目跟文獻(xiàn)

• 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞（如乳腺癌、肺癌細(xì)胞）孵育 24 小時(shí)足夠；成纖維細(xì)胞遷移快，12-16 小時(shí)就夠；內(nèi)皮細(xì)胞慢，可能需要 36 小時(shí)

• 怎么判斷時(shí)間到了？可以在孵箱里觀察：用顯微鏡看小室膜下方，有明顯細(xì)胞附著就可以終止，別孵育太久 —— 否則下室細(xì)胞太多，會(huì)重疊在一起，沒(méi)法計(jì)數(shù)。

2. 固定和染色：別把膜弄破，別漏染

• 第一步：棄液

取出小室，先倒掉上室的培養(yǎng)基，再用 PBS 輕輕洗 2 次（別用勁沖，避免把膜上的細(xì)胞沖掉）

• 第二步：固定

用 4% 多聚甲醛（PFA）加滿上室，室溫固定 20 分鐘（固定是為了讓細(xì)胞貼在膜上，后續(xù)染色不會(huì)掉）

• 第三步：染色

棄掉 PFA，用 PBS 洗 2 次，然后加 0.1% 結(jié)晶紫染液（過(guò)濾后用，避免有雜質(zhì)），室溫染 15-20 分鐘 —— 結(jié)晶紫是細(xì)胞核染色，顏色深，計(jì)數(shù)清晰。

? 避坑：染色后一定要用 PBS 輕輕洗去多余染液，直到洗出的水變清 —— 否則背景顏色太深，細(xì)胞和膜分不清。

3. 擦去上室未遷移細(xì)胞：這步是 “數(shù)據(jù)準(zhǔn)確" 的關(guān)鍵

• 染色后，用無(wú)菌棉簽（或細(xì)胞刮子）輕輕擦去小室上表面的細(xì)胞（這些是沒(méi)遷移過(guò)去的），擦的時(shí)候要順著一個(gè)方向，別來(lái)回蹭 —— 避免把膜擦破，或者把下表面的遷移細(xì)胞擦掉。

• 擦完后可以在顯微鏡下看一眼：上表面沒(méi)殘留細(xì)胞，下表面有紫色的細(xì)胞，就說(shuō)明擦干凈了。

四、結(jié)果統(tǒng)計(jì)：別只數(shù) 1 個(gè)視野，這樣才客觀

很多人隨便找個(gè)視野數(shù)細(xì)胞，最后數(shù)據(jù)波動(dòng)大，審稿人根本不認(rèn)可。正確的統(tǒng)計(jì)方法，要保證 “隨機(jī)性" 和 “重復(fù)性"。

1. 拍照：選 5 個(gè)固定視野，避免主觀選擇

• 這個(gè)步驟一般用不到那種精密的實(shí)驗(yàn)室儀器，我們把小室放在生物顯微鏡下，用 10× 物鏡（視野大，計(jì)數(shù)方便），拍上、下、左、右、中 5 個(gè)視野（每個(gè)視野間距盡量一致），別只拍細(xì)胞多的地方 —— 否則數(shù)據(jù)偏高，不客觀。

• 拍照時(shí)保持曝光一致：同一個(gè)實(shí)驗(yàn)的所有樣本，曝光時(shí)間、焦距都要一樣，避免后續(xù)分析時(shí)因亮度不同導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。

2. 計(jì)數(shù)：手動(dòng)計(jì)數(shù) + 軟件分析，雙重驗(yàn)證

• 手動(dòng)計(jì)數(shù)：用 ImageJ 軟件打開(kāi)圖片，用 “Cell Counter" 插件，逐個(gè)視野數(shù)細(xì)胞（紫色的細(xì)胞核都算），5 個(gè)視野取平均值

• 軟件分析：如果樣本多，可以用 ImageJ 的 “Threshold" 功能，設(shè)置合適的閾值（把細(xì)胞和背景分開(kāi)），然后用 “Analyze Particles" 自動(dòng)計(jì)數(shù)，最后和手動(dòng)計(jì)數(shù)對(duì)比，誤差在 10% 以內(nèi)就可以用。

?? 注意：如果細(xì)胞重疊太多（比如孵育時(shí)間太長(zhǎng)），自動(dòng)計(jì)數(shù)會(huì)不準(zhǔn)，必須手動(dòng)計(jì)數(shù)，或者在染色前用胰酶把下室的細(xì)胞消化下來(lái)，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)（更準(zhǔn)確，但步驟多）。

3. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)：至少 3 次獨(dú)立重復(fù)，別偷懶

• 單個(gè)樣本做 3 個(gè)復(fù)孔（比如對(duì)照組 3 孔，處理組 3 孔），然后至少做 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（不同天做），最后用 “平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）" 表示數(shù)據(jù)，用 t 檢驗(yàn)或 ANOVA 做統(tǒng)計(jì)分析 —— 這樣數(shù)據(jù)才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，審稿人才會(huì)認(rèn)可。

五、常見(jiàn)問(wèn)題排查：做不出數(shù)據(jù)？先看這 5 點(diǎn)

最后總結(jié)幾個(gè)客戶常問(wèn)的問(wèn)題，幫大家快速定位問(wèn)題所在：

     其實(shí) Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)，只要把 “膜的預(yù)處理、血清濃度差、細(xì)胞狀態(tài)、計(jì)數(shù)方法" 這幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)把控好，就能穩(wěn)出數(shù)據(jù)。如果還有其他問(wèn)題，比如不知道選哪種孔徑的小室，或者需要匹配特定細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)耗材，也可以進(jìn)入蘇州阿爾法生物咨詢我 —— 畢竟我們每天和這些實(shí)驗(yàn)耗材打交道，對(duì)不同細(xì)胞的適配性還是很熟的。

最后提醒一句：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中做好記錄（比如細(xì)胞濃度、孵育時(shí)間、染色時(shí)間），下次再做就能直接復(fù)用參數(shù)，不用再?gòu)念^摸索啦～